Na obrazie Jana Matejki widzimy astronoma, Mikołaja Kopernika, przebywającego nocą na szczycie budynku we Fromborku i obserwującego niebo. Młody mężczyzna, z kruczoczarnymi włosami średniej długości, ubrany jest w ciemny płaszcz z futrzanym obszyciem. W pozycji klęczącej, ustawiony do odbiorcy en face, spogląda on ze spokojną i jakby natchnioną miną w niebo, rozpościerając na boki ramiona. W jednej dłoni trzyma cyrkiel, drugą wyciąga przed siebie, jakby chciał czegoś dotknąć. Wokół niego, na podłodze oraz oparte o barierkę, znajdują się pomoce naukowe służące Kopernikowi do opracowywania teorii heliocentrycznej. Nad jego głową rozpościera się gwieździste niebo, a za jego plecami, z lewej strony, widzimy wieże fromborskiej katedry.
Na otwartej kompozycji Matejki nagromadzonych zostało sporo różnego rodzaju elementów o znaczeniu symbolicznym. Realistyczny sposób obrazowania sprawia, że dzieło polskiego malarza wygląda bardzo wymownie, a każdy ze szczegółowo odmalowanych detali sprawia wrażenie niemal namacalnego. Sylwetka Kopernika jest dość dynamiczna za sprawą szerokich gestów i mocno pofałdowanej tkaniny płaszcza. Ekspresyjna postać astronoma kontrastuje ze spokojem w układzie pozostałych elementów kompozycji.
Kolorystyka obrazu jest silnie stonowana i przy tym dość szeroka, gdyż poza dominującymi błękitami i szarościami widzimy tutaj także sporo beżu, brązu, ugru oraz ceglastej czerwieni na spowitych mrokiem murach katedry. Bardzo ciekawym zjawiskiem na obrazie jest światło. Nie jest ono bowiem naturalne, gdyż jego intensywny, ciepły blask nie mógłby pochodzić od księżyca; nie jest też sztuczne. Jasny blask oświetlający sylwetkę Kopernika, w szczególności zaś jego twarz, pochodzi od Boga, z którym astronom prowadzi dysputę, zgodnie z podtytułem obrazu.
Jan Matejko interpretuje olśnienie Kopernika jako objawienie od Boga. To bardzo ciekawy punkt widzenia, biorąc pod uwagę, iż teoria heliocentryczna odrzucana była początkowo przez Kościół jako niezgodna z teologią i przez to heretycka. W interpretacji Matejki okazuje się jednak, że odwagę w głoszeniu ekscentrycznych wówczas poglądów, czerpał astronom z siły otrzymanej od Boga i to nikt inny, jak właśnie Stwórca, przekazał mu prawdy na temat funkcjonowania Ziemi we wszechświecie, które następnie Kopernik spisał w dziele „O obrotach sfer niebieskich”.